ELISA成功秘笈

ELISA 作為經(jīng)典的免疫檢測方法，看起來(lái)很平常，然而真正做好它并不容易。有哪些秘笈，讓上海仁捷生物 的 ELISA 專(zhuān)家告訴你：

1. 確定您的樣本類(lèi)型和試劑盒可以兼容

常見(jiàn)樣本類(lèi)型有血清，血漿，細胞培養上清，如果是廠(chǎng)家實(shí)驗驗證過(guò)的，可根據產(chǎn)品說(shuō)明購買(mǎi)使用?！咀⒁猓貉獫{制備用到的抗凝劑有 EDTA、檸檬酸鹽、肝素等多種，相應的血漿性質(zhì)存在差異，需單獨確認兼容性】。

特殊樣本，如尿液、胸腹水、腦脊液、灌洗液、淚液，組織勻漿液等，可能缺乏廠(chǎng)家數據支持，這并不是說(shuō)試劑盒無(wú)法應用于這些樣本，而是需要咨詢(xún)有相關(guān)經(jīng)驗人士或自行實(shí)驗驗證可行性（如需進(jìn)行摻入回收實(shí)驗）。

2. 試劑盒檢測范圍需要匹配樣本中標志物濃度

ELISA 試劑盒的定量檢測范圍需參考標準曲線(xiàn)，在標準曲線(xiàn)zui低和zui高濃度區間內屬于線(xiàn)性范圍，其中的值是可信和可定量的。濃度高于線(xiàn)性范圍的樣品要稀釋到線(xiàn)性范圍內來(lái)測量，而濃度低于線(xiàn)性范圍的樣品，其測量值不能用于計算濃度，只能用做參考。有一種常見(jiàn)的相關(guān)情況是：健康人樣本中很多標志物的濃度偏低，測量值低于標準曲線(xiàn)zui低值。

3. 樣本收集有講究

以血清為例，樣本收集可參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，但需注意以下要點(diǎn)。樣本盡量用無(wú)菌管收集，避免細菌的酶類(lèi)和代謝產(chǎn)品對結果的影響。采集過(guò)程要避免溶血，因為紅細胞溶解釋放的活性物質(zhì)可能會(huì )影響檢測。保存過(guò)程中如有沉淀，應離心后取上清液。樣本若不立即測定，建議按照每次使用量分裝保存在 -20℃，每次檢測使用一管，即避免交叉污染和反復凍融，有能保證檢測結果的平行可比性。

4. 實(shí)驗前要準備好相應試劑

提前將所有試劑平衡到室溫環(huán)境，這個(gè)過(guò)程大致需半小時(shí)左右。洗液是濃縮液，如有結晶析出，需*溶解后再進(jìn)行稀釋。A、B 兩管顯色底物在使用前15分鐘按 1:1 配成混合液。為保證蛋白標準品溶液配制質(zhì)量，蛋白標準品為凍干粉，重溶前需將管子離心，加入說(shuō)明書(shū)的緩沖液，慢速在搖床上搖勻或顛倒混勻，至少 15 分鐘，不建議用槍頭吹打。溶解后如需保存，按每次使用量分裝后根據說(shuō)明書(shū)要求的溫度保存。梯度稀釋蛋白標準品時(shí)，建議用聚丙烯管（對蛋白吸附力很低），每步都要充分混勻且更換新槍頭，確保梯度準確性。

5. 儀器設備的準備也*

相關(guān)設備包括移液器、洗板機/搖床和酶標儀。移液器的準確性對于ELISA實(shí)驗結果的可靠性十分關(guān)鍵，需要確保定期校準維護。搖床的使用是為了讓反應體系快速達到平衡，獲得穩定、可重復的結果。不用搖床對實(shí)驗通常的影響是，OD 值低，CV 大。酶標儀等設備使用前提前 15 分鐘開(kāi)機預熱。

6. 預實(shí)驗：通常預實(shí)驗包括全部標準曲線(xiàn)和小量樣本。

預實(shí)驗有兩個(gè)主要目的，一來(lái)是熟悉實(shí)驗流程，發(fā)現可能忽略的問(wèn)題；二來(lái)是測試樣本和試劑盒是否匹配，一旦出現不匹配的情況，不至于浪費過(guò)多樣本。另外是對樣品中目的分析物的豐度作一下大致了解，以確定合適稀釋度。

7. 剩余的試劑盒材料要妥善保存

標準品分裝后按說(shuō)明書(shū)要求的溫度保存，這樣可以避免污染，對要求冷凍保存的標準品還可以避免反復凍融；酶標板放回錫箔紙袋，加入干燥劑，封緊封口，4℃保存。忌未將酶標板*平衡至室溫，就放回錫箔紙袋，因為此時(shí)由于溫度差，酶標板上會(huì )有水汽，不利于穩定保存。

8. 加樣要快速準確，避免氣泡

加樣時(shí)間宜控制在 15 分鐘內。加樣前要將樣本混勻，特別是凍存后融化的樣本（自然融化的血清等樣本會(huì )有分層現象），應上下顛倒充分混勻，注意動(dòng)作輕緩，避免產(chǎn)生氣泡。如凍存融化后的樣本有沉淀，可以再次離心。整個(gè)加樣過(guò)程都要注意避免產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì )影響蛋白的相互結合，而影響反應進(jìn)行。

9. 孵育時(shí)要保證溫度均勻，防止揮發(fā)變干

孵育時(shí)壓緊封口膜。多塊板一起實(shí)驗時(shí)，要平放各板，不要疊放，以免因溫度不均造成漂移或邊緣效應。

10. 洗板機的應用

使用洗板機，不但可以降低勞動(dòng)強度，而且有利于保證 ELISA 測試的穩定性。目前的全自動(dòng)洗板機不但具有很多實(shí)用的洗滌動(dòng)作，如底部沖洗，兩點(diǎn)吸液，震動(dòng)，交叉吸液；還可以根據需要調節沖洗壓力，沖洗距離，沖洗時(shí)間等參數。通過(guò)優(yōu)選這些動(dòng)作和參數，能保證良好的洗滌效果。洗板機的性能對于結果準確性影響也很大，好的洗板機要保證洗板后的殘留液盡可能的少，一般不超過(guò) 2μL，以洗滌后用人工拍板墊紙不濕為準。應定期檢查抽吸針頭是否堵塞。洗液如果含有吐溫，應隨用隨配。

11. 手動(dòng)洗板的操作指南

加洗液要快速，沒(méi)有多道移液器可以使用洗瓶。洗液應新鮮配制，以免被其他試劑污染，或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水紙上拍板，選用無(wú)粉塵和碎屑的吸水紙。需要用力拍板，使孔內沒(méi)有可見(jiàn)液體掛壁；但也不能太重，不能讓樣品干太久。酶標板拍干后立即做后續的加液。

12. 顯色反應的關(guān)鍵點(diǎn)

ELISA 實(shí)驗是個(gè)酶促底物顯色反應，隨時(shí)間增加，顯色變深，所以選擇*時(shí)間終止反應是得到準確的標準曲線(xiàn)和樣本濃度的重要因素。終止過(guò)程要*。使用的 TMB 底物時(shí)*終止點(diǎn)是黃色，不會(huì )有任何程度的藍色或綠色，終止過(guò)程中必要時(shí)可以震蕩 96 孔板，或用槍頭抽吸混勻（終止液含強酸，避免腐蝕）。

13. 數據分析

按照說(shuō)明書(shū)推薦的數據分析方法做曲線(xiàn)擬合及分析。說(shuō)明書(shū)中的標準曲線(xiàn)是在廠(chǎng)商的實(shí)驗室中，由非常有經(jīng)驗的操作人員得到的結果?？蛻?hù)的標準曲線(xiàn)和說(shuō)明書(shū)中的標準曲線(xiàn)可能存在不同，但不等于不好。通常判斷標準曲線(xiàn)合格的標準為：背景OD 值 <0.2；zui高點(diǎn) OD 值>1.0；相關(guān)系數 R2 接近或等于 1。只要滿(mǎn)足這些條件的標準曲線(xiàn)都是可以使用的。

結語(yǔ)

當您了解并掌握了 ELISA 實(shí)驗的這些，離做出zui棒的 ELISA 就只有一步之遙了，接下來(lái)不妨到 上海仁捷生物業(yè)界金標準的 ELISA 試劑盒中挑選一款適合您的產(chǎn)品，去獲得穩定可靠的實(shí)驗數據嘍。