小反芻獸疫病毒檢測試劑盒-PCR法

【檢驗原理】

本試劑盒針對小反芻獸疫病毒的高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含小反芻獸疫病毒基因組模板的情況下，PCR反應得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過(guò)程中相應通道信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監測和輸出，實(shí)現檢測結果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為偶蹄獸類(lèi)基因組DNA，陽(yáng)性對照為失去活性的小反芻獸疫病毒cDNA。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 適用標本類(lèi)型：發(fā)病動(dòng)物血液、空腸及小腸腸內容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結等)和病毒培養液。

2. 標本采集，方法如下：

(1) 血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml，轉至5ml 的干燥管中，密閉送檢。

(2) 腸內容物：無(wú)菌條件下取腸道內容物約1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中，立即送檢。

(3) 組織臟器：取發(fā)病動(dòng)物腸道組織及腸系膜淋巴結等組織約1g，置一1.5ml的潔凈離心管中，密閉送檢。

3.應避免標本間交叉污染。

4.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存；如需長(cháng)期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著(zhù)液體。

（2）核算當次實(shí)驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實(shí)驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數（1T）+陽(yáng)性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數

（3）在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣本準備（樣本處理區）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽(yáng)性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽(yáng)性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴增區）

（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關(guān)參數進(jìn)行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時(shí)不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

 （1）陽(yáng)性對照：有典型S型擴增曲線(xiàn)或Ct值≤35。

 （2）陰性對照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線(xiàn)形為直線(xiàn)或輕微斜線(xiàn)，無(wú)指數增長(cháng)期。

2.標本結果判定：

（1）陽(yáng)性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長(cháng)期。

（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時(shí)應對標本進(jìn)行重復檢測，如重復實(shí)驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長(cháng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無(wú)Ct值。

【檢驗結果的解釋】