線(xiàn)粒體呼吸鏈復合體Ⅴ活性測試盒實(shí)驗科研

線(xiàn)粒體呼吸鏈復合體Ⅴ活性測試盒實(shí)驗科研

測定意義：線(xiàn)粒體復合體Ⅴ又稱(chēng)F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養細胞的線(xiàn)粒體中，由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過(guò)程水解ATP。此外，復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線(xiàn)粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。

測定原理：復合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過(guò)測定Pi增加速率來(lái)測定復合體Ⅴ活性。

需要的儀器，耗材:可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。


樣本處理
1. 稱(chēng)取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細胞，加入 1.0 mL 提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2. 4 ℃ 600g 離心 10min。

3. 將上清液移至另一離心管中，4 ℃ 11000g 離心 15min。

4. 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線(xiàn)粒體泄漏的復合體Ⅴ（此步可選做，可以判斷線(xiàn)粒體提取效果）。

5. 在沉淀中加入 600μL 試劑一，超聲波破碎（功率 20%，超聲 5 秒，間隔 10 秒，重復 12 次），用于復合體Ⅴ酶 活性測定，并且用于蛋白含量測定。