*elisa試劑盒實(shí)驗操作的注意事項
一、ELISA操作前準備工作
*elisa試劑盒的選擇
ELISA操作前，應做好實(shí)驗的設計、選擇適合自己檢測范圍和靈敏度的*elisa試劑盒、提前訂購和準備試劑及耗材、處理樣本等準備工作。
樣本處理
在收集標本前需有一個(gè)完整的計劃，需要清楚要檢測的成份是否足夠穩定。ELISA檢測提倡新鮮標本盡早檢測，對收集后當天就進(jìn)行檢測的標本，及時(shí)儲存在4℃備用，如有特殊原因需要周期收集標本，請取材后，將標本及時(shí)分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解，直接影響實(shí)驗質(zhì)量，所以避免反復凍融。
二、ELISA標準品溶解
標準品是*elisa試劑盒的檢測抗原的一個(gè)度量標尺，因此標準品的溶解、倍比稀釋和保存要特別注意以下細節：凍干標準品溶解按照說(shuō)明書(shū)的要求，準確復溶。在冰上操作標準品為佳，靜止5－10分鐘，輕輕搖勻后按照一次量分裝，在-20度或-70度保存。標準品嚴禁反復凍融。標準品的倍比稀釋?xiě)孪茸龊脺蕚?，如離心管的準備和編號以及稀釋液的準備；稀釋時(shí)，應充分混勻；采用進(jìn)口或者硅化的EP管，減少蛋白吸附。在實(shí)驗孔內進(jìn)行倍比稀釋時(shí)，注意操作規范，槍頭勿刮劃預包被的孔底。
三、ELISA操作中的洗滌
洗滌是ELISA實(shí)驗中是多次數的操作，也是非常重要的步驟。不嚴格的洗滌容易出現洗不干凈或交叉污染現象，實(shí)驗重復效果差的現象。不管用多道加樣器、洗瓶、吸管，還是洗板機，嚴格按照說(shuō)明書(shū)操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時(shí)間和洗滌次數。注意標準化操作將減少實(shí)驗誤差和不同實(shí)驗之間的誤差。操作者常出現洗板不干凈現象，請比照“手工洗板小貼士”操作：
a)洗液不要溢出孔外，以免污染相鄰的孔，特別是每次洗板的前兩遍，若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定會(huì )增高。
b)特別注意：設計實(shí)驗的時(shí)候要考慮實(shí)驗孔的位置，保證甩掉洗液時(shí)，空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側或分開(kāi)較好。同時(shí)注意甩掉洗液的動(dòng)作翻轉（從正上方旋轉120－150度）要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉來(lái)甩液體！甩出后以直線(xiàn)方式補2－3次甩出液體。
c)用干凈的濾紙，不要用衛生紙，因為細小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底，導致洗板不干凈，結果偏高或偏低，重復孔的數值也會(huì )相差很大。
d)每次拍板不要重復在一個(gè)地方拍，特別是洗去酶的步驟；拍板不宜過(guò)輕，否則拍不干凈，拍板很用力不會(huì )對蛋白有什么影響。但注意不要太重，以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下，后一次一定要扣干凈。
e)不能減少洗液體積、洗板時(shí)間和次數。洗板時(shí)間太短，洗板效果不佳。延長(cháng)洗板時(shí)間和增加洗板次數可以使背景更干凈。
四、ELISA的標準曲線(xiàn)如何擬合？
一般情況按照說(shuō)明書(shū)推薦方法擬合標準曲線(xiàn)。標準曲線(xiàn)可以由酶標儀附帶軟件自動(dòng)生成，也可手動(dòng)制作。標準曲線(xiàn)呈“S”形曲線(xiàn)，兩端趨于水平，中間趨于線(xiàn)性，中間部分為較佳的檢測范圍。當標準品的量超過(guò)與包被抗體結合的量，此時(shí)標準品已飽和，再增加標準品的量，其OD值不再變化，故當標準品達到一定濃度后，曲線(xiàn)就趨于水平。一般廠(chǎng)商給出的濃度范圍落在中間線(xiàn)性范圍，根據標準曲線(xiàn)，可以測出樣本的濃度。按照科學(xué)分析方法，如果存在“奇異點(diǎn)”或者“污點(diǎn)”，直接采用線(xiàn)性分析不是很好，要對擬合標準曲線(xiàn)的幾個(gè)點(diǎn)進(jìn)行取舍，同時(shí)也可改用雙對數直線(xiàn)擬合或者四因素曲線(xiàn)擬合。
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更新時(shí)間：2019-05-27 
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