做ELISA實(shí)驗需要注意哪些問(wèn)題？

Elisa實(shí)驗中應該注意的問(wèn)題,包括樣品稀釋、試劑盒平衡、樣品和試劑的混勻、加樣、溫育等問(wèn)題.Elisa試劑盒有著(zhù)準確性高、靈敏度高、特異性強的諸多優(yōu)點(diǎn),深受廣大用戶(hù)朋友的喜愛(ài).然而,在實(shí)驗過(guò)程中,也需要注意很多問(wèn)題.對此,上海哈靈生物提醒你您,需要遵守一些規則,才能更好地進(jìn)行實(shí)驗,取得較好的實(shí)驗成果.

Elisa方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定.在Elisa測定中影響因素較多,在檢測過(guò)程中除正常反應外,有時(shí)常見(jiàn)到一些錯誤的結果.引起ELISA測定錯誤結果的原因主要有：標本因素；試劑因素；操作因素.

1．樣品稀釋 

一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數均通過(guò)大量試驗確定,以保證試驗的靈敏度和特異性.酶聯(lián)免疫反應是一種敏感性很高的反應,如果血清不稀釋,不可避免會(huì )產(chǎn)生很強的非特異性反應,出現假陽(yáng)性.

2．試劑盒平衡 

Elisa中所有試劑和板條均應在試驗前平衡至室溫(約25℃),一般需在室溫放置20～30分鐘以上.平衡時(shí)間太短會(huì )造成試劑混勻不夠,樣品孵育時(shí)間相對縮短,ELISA反應不夠充分.冬季室溫低,可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘.

3．樣品和試劑的混勻 

在稀釋前、后的樣品必須充分混勻,所有試劑在加樣前也須搖勻,以保證試驗的均一性.

4．加樣 

加樣是一項很重要的步驟.加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產(chǎn)生氣泡.加樣太快,無(wú)法保證微量加樣的準確性和均一性.加在孔壁上部的非包被區,易導致非特異吸附.

5．溫育 

溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為關(guān)鍵的一個(gè)因素.ELISA作為一種固相免疫測定,抗原抗體的結合反應在固相上進(jìn)行,要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結合,必須在一定的溫度條件下反應一定的時(shí)間.

6．洗板 

固相免疫測定技術(shù)是一種非均相免疫測定技術(shù),需以洗滌操作將特異結合于固相的抗原或抗體與反應溫育過(guò)程中吸附的非特異成份分離開(kāi)來(lái),以保證ELISA測定的特異性.洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘,甩去板孔中洗液后,一定要大力拍干；及時(shí)更換吸水紙,尤其是拍過(guò)酶標記物的吸水紙一定要棄去,否則可能影響試驗結果.

7．顯色 

顯色一定要控制時(shí)間,根據試劑盒說(shuō)明操作即可.一般來(lái)說(shuō),顯色時(shí)間過(guò)短,結果偏低；顯色時(shí)間過(guò)長(cháng),空白增高或者非特異性顯色增加.

8．比色 

比色要注意波長(cháng)的選擇.以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用,而前者比色波長(cháng)為450nm,后者為492nm,濾光片需根據要求隨時(shí)更換.因此,容易出現濾光片錯用的問(wèn)題.